产品货号:
BTN160684A
中文名称:
零背景平末端克隆试剂盒(Amp抗性)
英文名称:
Blunt Cloning Kit(Resistance to Ampicillin)
产品规格:
25次
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本产品是基于Topoisomerase能够在几秒钟之内高速连接DNA片段的原理开发的无背景克隆试剂盒,它使用了本公司通过定点突变改良的TOPO酶,连接效率比野生型更高。
产品特点:
1. 高效快速,连接反应几乎在几秒钟内完成,连接率几乎达到100%。
2. 适用于pfu、KOD等高保真聚合酶扩增的平末端片段的克隆。
3. 无杂带或引物二聚体的PCR扩增产物可以不经过纯化直接用于连接反应。
4. 零背景,无需IPTG-X-Gal蓝白斑筛选,故不需要IPTG-X-Gal培养基。
5. 本试剂盒按10μl标准反应体系。
6. 提供含Amp和Kan两种抗性的载体供选择(BTN160684A是含Amp抗性TOPO载体,BTN60684K是含Kan抗性TOPO载体)。
产品组成:
保存条件:-20℃,有效期一年。
自备试剂:DNA插入片段、感受态细胞、SOC或LB培养基和培养皿(含抗菌素和不含的)
使用方法:
1. 如果是PCR制备插入片段,所用引物不能磷酸化,使用pfu、KOD等产生平末端片段的高保真DNA聚合酶。为保证扩增产物的完整性,PCR循环结束后,再延伸5-10分钟,确保片段延伸完全。
2. 电泳检测并相对定量PCR片段(跟DNA marker比较)。根据插入片段长度和下表确定每次连接反应需要的最佳用量:
3. 在一个干净的塑料离心管中,室温下(不要放在冰上)设置如下连接反应体系:
注意:如果使用未经纯化的PCR产物,则需要加入量不能超过1μl,否则PCR体系会干扰连接体系。
4. 轻柔吹打混匀后,短暂离心,常温(20-30℃)放置0-5分钟。如果在冬天室温低于20℃,建议使用25℃水浴或金属浴。注意:连接时间超过5分钟的话连接效率会降低。
5. 如果当天不转化,可以将离心管放-20℃保存。如果转化,则取5μl连接液加到50-100μl刚刚融化的感受态细胞中,轻柔混匀。
注意:本产品要求感受态细胞的转化效率不得低于5×10E7cfu/ug。
6. 如果片段长度小于2 Kb,则不需要冰浴和热激,直接在离心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培养基,然后取200μl涂盘。也可以先3000g离心2分钟后,弃掉大部分上清,只留约100μl左右,然后重悬细菌后全部涂盘在含Amp的培养皿上,37℃过夜培养。
7. 如果片段长度长于2 Kb,则按常规转化方式,先冰浴2-30分钟,然后42℃热激30秒,冰上防放置2分钟,再在离心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培养基,37℃ 250rpm培养60分钟,然后取200μl涂盘。也可以先3000g离心2分钟后,弃掉大部分上清,只留约100μl左右,然后重悬细菌后全部涂盘在含Amp的培养皿上,37℃过夜培养。
8. 用M13F/M13R通用引物进行菌落PCR或直接测序来鉴定重组子。
该载体的多克隆位点序列:
通用测序引物序列:
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R:CAGGAAACAGCTATGACC
相关搜索:零背景平末端克隆试剂盒(Amp抗性),Blunt Cloning Kit(Resistance to Ampicillin)
产品特点:
1. 高效快速,连接反应几乎在几秒钟内完成,连接率几乎达到100%。
2. 适用于pfu、KOD等高保真聚合酶扩增的平末端片段的克隆。
3. 无杂带或引物二聚体的PCR扩增产物可以不经过纯化直接用于连接反应。
4. 零背景,无需IPTG-X-Gal蓝白斑筛选,故不需要IPTG-X-Gal培养基。
5. 本试剂盒按10μl标准反应体系。
6. 提供含Amp和Kan两种抗性的载体供选择(BTN160684A是含Amp抗性TOPO载体,BTN60684K是含Kan抗性TOPO载体)。
产品组成:
组分 | 编号 | 规格 |
TOPO-Amp Blunt载体 | BTN160684A | 25μl |
连接缓冲液 | BTN160684B | 25μl |
M13F引物 | 50uL | |
M13R引物 | 50uL | |
超纯水 | BTN100935 | 1mL |
保存条件:-20℃,有效期一年。
自备试剂:DNA插入片段、感受态细胞、SOC或LB培养基和培养皿(含抗菌素和不含的)
使用方法:
1. 如果是PCR制备插入片段,所用引物不能磷酸化,使用pfu、KOD等产生平末端片段的高保真DNA聚合酶。为保证扩增产物的完整性,PCR循环结束后,再延伸5-10分钟,确保片段延伸完全。
2. 电泳检测并相对定量PCR片段(跟DNA marker比较)。根据插入片段长度和下表确定每次连接反应需要的最佳用量:
插入片段长度 | 最佳用量 |
100-1000bp | 20-50ng |
1000-2000bp | 50-100ng |
2000-5000bp | 100-200ng |
3. 在一个干净的塑料离心管中,室温下(不要放在冰上)设置如下连接反应体系:
加入物 | 加入量 |
纯化后的PCR产物 | 不超过8μl |
TOPO-Amp Blunt载体 | 1uL |
连接缓冲液 | 1uL |
超纯水 | 补到10uL |
注意:如果使用未经纯化的PCR产物,则需要加入量不能超过1μl,否则PCR体系会干扰连接体系。
4. 轻柔吹打混匀后,短暂离心,常温(20-30℃)放置0-5分钟。如果在冬天室温低于20℃,建议使用25℃水浴或金属浴。注意:连接时间超过5分钟的话连接效率会降低。
5. 如果当天不转化,可以将离心管放-20℃保存。如果转化,则取5μl连接液加到50-100μl刚刚融化的感受态细胞中,轻柔混匀。
注意:本产品要求感受态细胞的转化效率不得低于5×10E7cfu/ug。
6. 如果片段长度小于2 Kb,则不需要冰浴和热激,直接在离心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培养基,然后取200μl涂盘。也可以先3000g离心2分钟后,弃掉大部分上清,只留约100μl左右,然后重悬细菌后全部涂盘在含Amp的培养皿上,37℃过夜培养。
7. 如果片段长度长于2 Kb,则按常规转化方式,先冰浴2-30分钟,然后42℃热激30秒,冰上防放置2分钟,再在离心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培养基,37℃ 250rpm培养60分钟,然后取200μl涂盘。也可以先3000g离心2分钟后,弃掉大部分上清,只留约100μl左右,然后重悬细菌后全部涂盘在含Amp的培养皿上,37℃过夜培养。
8. 用M13F/M13R通用引物进行菌落PCR或直接测序来鉴定重组子。
该载体的多克隆位点序列:
通用测序引物序列:
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R:CAGGAAACAGCTATGACC
相关搜索:零背景平末端克隆试剂盒(Amp抗性),Blunt Cloning Kit(Resistance to Ampicillin)